自己动手，筛选酿酒酵母
本帖最后由 清酒厂长 于 2015-8-12 20:10 编辑19世纪70年代，德国科学家柯赫研究牛的炭疽病时，将病牛的血液转移到人工配制的养料中，在适宜条件下培养，使得血液中的各种细菌大量繁殖，形成了不同形状和颜色的细菌群体。 他将这些细菌分别注射到健康牛的体内，结果发现牛的炭疽病是由炭疽芽孢杆菌引起的。在此过程中，柯赫所采用的细菌培养方法， 开创了微生物分离和纯培养技术的先河。
酵母菌、霉菌都需要从生活环境中获取各种营养物质， 以维持自身的生命活动。由于微生物代谢方式的不同，因而对营养物质的需求也是有差异的。根据这个特点，在进行微生物的分离和纯培养时，可根据微生物生长繁殖和代谢的需要，将各种营养物质混合在一起，配制成适合微生物生存的营养基质——培养基。其中，将溶化后的固体培养基基质倒入无菌培养皿， 冷却凝固后制成的培养基称为平板培养基。
材料器具：
生稻谷、土壤、醪糟 、琼脂、丙酸钠，氯霉素，TTC, 钢丝、恒温培养箱、培养皿、试管
筛选目标：酿酒用酵母菌，要求耐酒精18度，有醇香、根霉、米曲霉、毛霉、红曲霉
步骤：
1，将生稻谷与土壤、葡萄皮、葡萄干、放入300g水中，加100g醪糟汁，加0.2%柠檬酸，2%丙酸钠，0.01%氯霉素，28℃培养两天，得到混合酵母菌液；
2，将醪糟加一倍水与2%琼脂煮沸，过滤出糖液，冷却到45度，倒入培养皿，冷凝成果冻状；
3，用钢丝沾取混合菌液，在培养皿内的果冻上进行划线。
通过平板划线， 聚集的多种微生物被分散到培养基的表面。 在数次划线后，可以分离得到由一个细菌繁殖而来的菌落。
4,划线完毕后， 盖上培养皿盖， 将培养皿倒置，
放入30℃的恒温培养箱中培养24 h
在固体平板培养基上，单个微生物细胞或孢子可生长繁殖成一个具有特定形状的菌落。 在一定培养条件下，微生物的菌落形状、大小、边缘、 隆起度和颜色等是稳定的。 酵母菌菌落较细菌菌落大而厚；霉菌形成的菌落较稀松， 多呈绒毛状、 絮状。 通过对菌落特征的观察可以识别微生物的类群。
5,纯化培养
挑取单个酵母菌菌落接种到培养基上，涂抹划线，仍在30℃恒温培养箱中培养24 h，可获得酵母菌的纯培养。检查后如果发现有杂菌，可进一步划线挑菌，直至纯化。
纯种酵母菌，划线培养的结果：
6，菌种扩大培养
将菌种刮下来，加入到100ml稀释一倍的灭菌醪糟中，10小时增加100倍。再将醪糟液扩大十倍，以此类推。
比较最后发酵效果。
7，酵母菌酿酒性能测试：
①产气发酵能力
将不同酵母加入小试管，试管内加满醪糟液，同一时间内气泡溢出液体多的，发酵力强。
②耐酸性能
将酵母加入不同酸度的醪糟液，观察气泡发生速度，分别以0.4%，0.8%，1.6%添加柠檬酸
③耐酒精性能
方法①，将酵母培养菌落中上层加入TTC培养基,避光培养酵母2小时，酵母产酒精能力越强，产生的染色红色越强，淡红色的弱，白色的是不产酒精的野生酵母。
方法②，将酵母加入不同酒精度的醪糟液，观察气泡发生速度，分别以6%，12%，16%体积添加酒精
从自然界直接分离筛选高产酒精酵母是育种工作中最经济实用的方法。
例子：采用含高浓度酒精培养基从自然界中分离到63 株酵母，经过四级筛选，得到高耐性、高产酒精的酵母菌株Cor-01。该菌株耐酒精度20 %vol，耐糖度22 °Bix，致死温度为55℃。以红薯淀粉为原料，在料水比1∶2、30℃、100 r/min、发酵72 h 的条件下，生料发酵,成熟醪酒精的体积分数达到16.2 %。
在发酵后期酒醅的酸度较高,且含有一定数量的低分子脂肪酸对酵母的发酵形成一定的抑制作用,使酒精的产率降低,是造成淀粉利用率低的重要因素。所以酒米精白要去掉脂肪。
④产香能力
嗅觉，香气评定。
酿酒所需菌种：米曲霉
米曲霉，是麦曲、清酒曲的主要菌种，是一种好气性真菌，曲霉属，菌丝生长期是白色，产生成熟孢子后一般呈黄绿色，后为黄褐色，培养适温为32度。米曲霉分泌强大的蛋白酶，还有淀粉酶、糖化酶、纤 维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，供酵母利用。
筛选自然界的米曲霉，可用针对米曲霉的“酒饼草”--黄蒿（又名臭蒿），抑制其他微生物，不抑制米曲霉，铺、盖在米饭上，7天后生满绿色米曲霉孢子。可接种米饭，制成米曲。或者将黄蒿粉碎，与生米粉拌匀，水团成丸子，7天后长满绿色米曲霉孢子。
根霉
根霉，主要是利用它分泌的淀粉糖化酶,将淀粉转化为葡萄糖。
筛选自然界的根霉，可用针对根霉的“酒饼草”--辣蓼草（又名水蓼），抑制其他微生物，不抑制根霉，粉碎拌入生米粉，水团成丸子，3天后晒干。可接种米饭，制成曲。
我自己用大米浸泡水，先加0.3%氢氧化钠，淘汰脆弱的微生物，后加柠檬酸中和，酸化，杀灭不耐酸的微生物，然后涂抹到砂锅底部，盖上盖子，培养三天的霉菌，似乎没有想要的米曲霉
可挑取上面的绿色孢子，制成麦曲，测试糖化能力。懒得弄了，谁知道是不是产生黄曲霉素的菌种呢，还是买纯种米曲霉吧。
紫外线照射黄曲霉素菌落，会产生黄绿色荧光，以此来鉴定黄曲霉素菌株。所以我在淘宝买了个紫外线手电筒，13包邮。晚上照一照，吓死了，
凡是照到含有荧光剂的东西，都会产生荧光。结果屋里鬼火闪闪，大部分塑料都有荧光，窗帘也有。
然后又在知网文章中发现，并且经过试验，黄色孢子的酿酒米曲霉不含黄曲霉素，虽然长得跟黄曲霉一样，但人家属于黄曲霉原变种，不一样就是不一样。汉奸的儿子也可以抗日嘛。用紫外线辐射还能让米曲霉变异，进化出白色孢子的版本。
又在淘宝买了TTC1瓶,、琼脂50克（似乎买到假货了，不凝固！）、30ml试管6个、9cm培养皿6个、12cm培养皿2个，杜氏管12个，胶头吸管1个，丙酸钠1Kg,氯霉素50g,乳酸1Kg,我这不是消费，而是投资生产工具。此前买了ph值计。
把福建药曲1粒捣碎，放进17%葡萄糖溶液，加0.6%乳酸，一夜后，药渣上浮，底层酵母冒泡，一天后长毛1cm。用镊子把表层霉菌块抓进培养皿，观察其姿势。把清液倒进试管，观察产气情况，ph值2.8。把底层渣加水摇匀，倒进试管，ph值3.8。奇怪，ph值2.8的强酸液中，产气比ph值3.8的多。
2015·6·23更新，鄙视上次淘宝卖我假琼脂的，评论也有两个说不凝固的，已下架，误我大事。重新下单琼脂100克。
每天头脑中冒出几十个想法，却连一个也无法贯彻到底。试图单品突破，聚焦于一点。米曲霉种曲制作中，总是感染产膜酵母，还没等产生孢子就有酒味了。米内部也变红褐色变软。淘宝买的菌种不纯，还要自己划线分离纯培养。做曲米成功过一次，20小时产生浓郁的煮栗子甜香，炒米粉加水20%；失败的是加水60%的。昨天做的醪糟也失败了，水不甜微酸味淡。还好只是200g小试。
2015年8月2日更新：
在淘宝从广东广西买了三种甜酒曲：东京根霉曲，根霉Q303,广西某甜酒种。据说Q303能产生香气的。验证一下。其余两种培养挑出根霉菌丝，做醪糟，品味其香气。目标是要找一种满屋生香的甜酒曲菌种。据说以前的某蜂甜酒曲是这样。
富集自然酵母：
将0.1克焦亚硫酸钠加入100克水中，然后吃葡萄，把没洗的皮小心剥到水中，再把葡萄梗放入水中，再加16%葡萄糖，半密封防果蝇（热天这货无孔不入）。48小时后，猛烈产气，底层产生一层白色酵母泥。此为野生葡萄酵母。将酵母泥与种曲，一起做小曲保存，测试其产酒效果。葡萄酒口味的米酒。
同上的方法：将各地小曲，与枸杞，分别富集其酵母。焦亚硫酸钠/钾,或0.01%氯霉素可以杀灭非酵母菌.
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8月12日更新：以市售药曲为种曲，加0.01%氯霉素，2%辣蓼草粉制曲，作为新种曲，杀灭原曲中的产酸菌，净化原曲中的杂菌，做出醪糟不酸的小曲。
学院派的高达上 :P虽然看不太懂 还是为楼主勇于实践的精神举臂高呼一下:curse: 这个消毒不完全，尤其是针对于产孢子的芽孢杆菌，我觉得最少也要高压锅01mp25min灭菌一下，没有超净台可以用紫外或者熏蒸！这样才纯，才有说服力啊 朱定国 发表于 2015-4-2 14:35
这个消毒不完全，尤其是针对于产孢子的芽孢杆菌，我觉得最少也要高压锅01mp25min灭菌一下，没有超净台可以 ...
pH值降到4以下可以抑制它么？ 这是制造异形的节奏迈？;P 制曲神贴，顶起 制曲神贴，顶起 清酒厂长 发表于 2015-4-2 14:59
pH值降到4以下可以抑制它么？
这个和PH指没有关系，因为孢子是休眠体，要么湿热0.1mp灭菌，要么干热160度2小时，还可以间接灭菌法（这种方法还是大学时学的，具体操作要查哈） 咋不更新了？这种技术帖不能沉！楼主不能太监哈！ zhengg229 发表于 2015-4-3 12:08
咋不更新了？这种技术帖不能沉！楼主不能太监哈！
突然感到这个贴很扯淡，缺乏可行性，哈哈;P
还是团元宵比较现实。 清酒厂长 发表于 2015-4-3 14:24
突然感到这个贴很扯淡，缺乏可行性，哈哈
还是团元宵比较现实。
千万别这样想，你这种培菌丶选育的方法其实非常科学。只是平常人没这种条件。希望你坚持！拜托！:handshake